Soutenance de thèse de Ons KHARRAT

Avec l’augmentation spectaculaire de la résistance aux composés antimicrobiens et le nombre limité de nouveaux composés développés, il est urgent de mettre au point des alternatives thérapeutiques. Les peptides antimicrobiens (PAMs) sont des alternatives naturelles prometteuses, avec une grande diversité de mécanismes d’action (MOAs) optimisés depuis des millions d’années. Comprendre leurs MOAs à l’échelle moléculaire/atomique est essentiel pour concevoir des molécules efficaces dérivées des PAMs. L’objectif de ma thèse était de déchiffrer les MOAs de deux PAMs cationiques riches en ponts disulfure prometteurs : ETD151, un peptide antifongique de 44 résidus dérivé des défensines d’insectes (Partie I) et AvBD103b, un peptide antimicrobien de 38 résidus du manchot royal pour son activité antibactérienne (Partie II). La défensine ETD151 est très active contre les champignons pathogènes pour l’Homme et les plantes, et ne présente pas de toxicité. Son mécanisme multifacette nécessite la présence de glucosylcéramides (GlcCers), lipides de la membrane fongique déterminants pour la croissance cellulaire et la virulence du champignon, et donc considérés comme des cibles prometteuses. Cibler les GlcCers fongiques est peu susceptible d'induire rapidement une résistance. En utilisant des approches multidisciplinaires, nous avons prouvé l'interaction moléculaire directe entre ETD151 et le GlcCer fongique, et l’avons étudié à l’échelle atomique. La première étape a consisté à caractériser, par spectrométrie de masse, les deux principales formes de GlcCer du champignon Botrytis cinerea, révélant des structures de base sphingoïde méthylée d19:2/h16:0 et d19:2/h16:1. Nous avons ensuite révélé qu’ETD151 reconnaissait spécifiquement ces GlcCer de B. cinerea insérés dans des liposomes, avec un Kd estimé de l’ordre du micromolaire (µM) par thermophorèse à micro-échelle (MST). Par RMN, nous avons montré que les deux boucles hydrophobes adjacentes d’ETD151 jouaient un rôle majeur dans l’interaction, et aussi dans l’insertion spécifique et la fluidification des liposomes contenant du GlcCer fongique. Enfin, nous avons démontré que le méthyle C9 spécifique aux champignons (absent des GlcCer de mammifères et de plantes) jouait un rôle majeur dans l’interaction. Les éléments biochimiques et structuraux clés que nous avons révélés pour le mécanisme moléculaire par lequel ETD151 cible les GlcCer fongiques in vitro fournissent une base solide pour la conception d’antifongiques mimant les défensines et ciblant spécifiquement les GlcCers fongiques méthylés. La défensine aviaire AvBD103b appartient à une sous-famille différente de défensines. Elle est active contre un large spectre de bactéries Gram+ et Gram-, y compris en milieu salé, et ne présente pas de toxicité. L’hypothèse actuelle est que le MOA d’AvBD103b est non spécifique et multifacette, ce qui défavoriserait le développement de résistance. L’objectif ici est de marquer le peptide et de suivre précisément sa distribution spatiale au cours de son attaque. Pour ce faire, nous avons d'abord transposé une technique innovante d'imagerie par fluorescence sur cellule unique, permettant de disséquer le mécanisme antibactérien des PAMs en temps réel, sur des Escherichia coli vivantes et dans des conditions physiologiques. Nos résultats préliminaires ont montré qu’AvBD103b se localisait préférentiellement dans l’anneau Z où se trouvent les protéines de division cellulaire, et dans la région septale où la synthèse du peptidoglycane est active. Pendant son attaque, AvBD103b resterait principalement à la surface de la cellule. Cependant, une partie du peptide pourrait accéder au cytoplasme et atteindre ainsi de potentiels partenaires moléculaires intracellulaires. Ces nouveaux éléments du mécanisme sont essentiels pour concevoir une nouvelle génération de molécules antibactériennes, en particulier contre les pathogènes qui prospèrent dans des environnements riches en sel (patients atteints de mucoviscidose).