Soutenance de thèse de Eric KAYA

Le développement de thérapies ciblées innovantes est un enjeu majeur en oncologie. Les affibodies (AfBs), en raison de leurs propriétés avantageuses (taille, stabilité, coût, affinités, tolérance), représentent une alternative prometteuse aux anticorps monoclonaux. Notre objectif est le développement de nouvelles constructions de di-affibodies pour des applications en bio imagerie et immunothérapie. Dans cette optique, nous rapportons la conception de nouveaux linkers fluorescents polyvalents (L1-L3, L1N) adaptés à l'assemblage covalent de motifs de reconnaissance spécifiques pour cibler des molécules biologiquement pertinentes. La plateforme d’ancrage fluorescente, un dérivé du dimethoxyquinacridinium, émet en rouge et constitue un élément clé pour la synthèse de conjugués et leurs analyses ultérieures. La synthèse de ces précurseurs a été optimisée en amont à travers des études cinétiques. De plus, les mesures spectrophotométriques de leurs interactions avec des biomolécules représentatives (SAB, ARN, ADN) ont démontré une faible affinité avec la protéine SAB (~mM), comparée aux affinités avec les acides nucléiques (ARN, ADN), de l’ordre du µM. La présence de groupements amines permet une fonctionnalisation simple avec des linkers PEG bifonctionnels (NHS, MI) de longueur variable (n = 2 ou 12) pour une bio conjugaison ultérieure. Les affibodies ont été produits par synthèse sur support solide (SPPS) avec un unique résidu de cystéine incorporé en position N-terminale (N-AfB; E-AfB) ou C-terminal (C-AfB). L’assemblage des différents constituants moléculaires (fluorophore, linker, affibody) a été réalisé à partir de réactions de bio conjugaison simple et rapide (NHS ester/amine, thiol/maléimide). Dans un premier temps, et pour démontrer le concept, nous avons conjugué nos linkers avec des affibodies ciblant HER2 (N-AfB ou C-AfB). Sept conjugués (mono- et di- AfBs) ont été obtenus et caractérisés. Leur liaison spécifique aux cellules SKOV3 surexprimant HER2 a été démontrée par cytométrie en flux, avec des affinités nano molaires, et visualisée par microscopie confocale. L'internalisation des constructions AfB dans les cellules SKOV3 a été étudiée grâce à la mesure de leur fluorescence en cytométrie après traitement à la trypsine. Dans une seconde partie, la versatilité des plateformes d’ancrage a été démontrée par la synthèse de deux di-AfBs bispécifiques ciblant simultanément HER2 (N-AfB ; C-AfB) et EGFR (E-AfB). Les tests sur lignées cellulaires (MDA-MB-231, SKBR3, SKOV3) ont montré que le conjugué bispécifique se liait aux deux cibles, lorsqu’elles étaient surexprimées, avec une affinité nano molaire, contrairement aux agents monovalents. En conclusion, la conception de linkers versatiles et des assemblages directionnels polyvalents ouvre des perspectives intéressantes pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses et/ou d’outils de diagnostic pour le suivi au niveau cellulaire.