Soutenance de thèse de Solweig CHARTIER

Ce projet de thèse visait à développer une stratégie analytique utilisant la thermophorèse à micro-échelle (MST) et l’électrophorèse capillaire (CE) pour évaluer quantitativement les interactions enzyme/petite molécule directement dans des lysats cellulaires, sans purification ni utilisation de radioactivité. Comme preuve de concept, nous avons étudié l'inhibition des LIM kinases (LIMK1 et LIMK2), des cibles thérapeutiques prometteuses pour la neurofibromatose de type 1, certains cancers et maladies neurologiques. Des centaines de molécules inhibitrices des LIMKs avec des constantes de dissociation (Kd) de l’ordre du nanomolaires in vitro ont été rapportées, mais seule la molécule LX7101 a atteint la phase clinique I/IIa, sans résultats publiés. La MST utilisée nécessite que l'un des partenaires de l'interaction soit fluorescent. Pour travailler dans des lysats cellulaires, la fluorescence rouge est optimale en termes de sélectivité et de sensibilité. Nous avons produit les protéines LIMK1, LIMK2, ainsi que leurs domaines catalytiques Kin1 et Kin2, fluorescentes dans les cellules HEK293 en les fusionnant avec la miRFP670 (λex/λem = 650/670 nm). Avant les essais MST, la production des protéines étiquetées a été confirmée par Western blot et leurs activités catalytiques par CE. Ce travail montre pour la première fois que la miRFP670 peut être utilisée comme protéine de fusion fluorescente pour des essais en MST, éliminant ainsi les étapes de purification de la cible à partir du lysat cellulaire. La méthodologie MST a été développée et validée en évaluant l'affinité de liaison des inhibiteurs LX7101, BMS-5, T56-LIMKi et TH-257. Nous avons également utilisé la MST pour évaluer les paramètres thermodynamiques (ΔH, ΔS et ΔG) des interactions entre les LIMKs et leurs inhibiteurs dans des lysats cellulaires. Les résultats montrent que l'entropie (ΔS) s'oppose à l'interaction, tandis que l'enthalpie (ΔH) la favorise. Pour développer des inhibiteurs de LIMKs capables de passer les essais cliniques, il serait alors bénéfique d'améliorer le terme entropique en développant des actifs plus hydrophobes. Les avantages de la MST pour mesurer les paramètres thermodynamiques et d'affinité de la liaison cible/ligand dans des conditions proches du in vivo en font un outil précieux en chimie médicinale et en santé. De plus, le couplage des essais d'activité catalytique et d'affinité via l'utilisation combinée de la CE et de la MST constitue une approche intéressante pour cribler des candidats médicamenteux, comprendre leurs mécanismes de liaison et leurs effets modulateurs dans un milieu cellulaire. L’approche développée est économe en réactifs, fiable, simple, robuste, rapide et parfaitement adaptée aux milieux biologiques complexes